161-用了这么久的bowtie2，却不知道它的结果含义？
刘小泽写于2020.2.4 经常出现这么一种情况，为了完成目标，一定会先快速做一遍，然后得到最直接的结果。等后来就会发现，原来其中还有很多不知道的事情
这次就会以bowtie2的结果为例，来说说为什么会有这种感受
首先还是先回顾下bowtie2的基本知识吧
它的官网在：http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
一句话概括这款软件：
Bowtie 2 is an ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences.
关于使用
使用它首先需要对参考基因组构建索引
【注意这里是基因组而不是参考转录组，因为它的BWA一样，是为基因组测序而生；如果是要比对参考转录组，那么就考虑hisat2吧】
关于索引有两种获得方法：
官网下载：提供了人、小鼠、大鼠的索引下载
自己构建：其实自己下载好参考基因组后，自己构建也是很方便的。只需要指定三个参数：一个线程数，一个参考基因组的位置，最后就是输出的索引前缀【一个小技巧就是输出的前缀直接用物种的缩写，比如mm10、hg19、ath等】
# 举个例子 ref=/home/genome/genome.fa bowtie2-build --threads 5 $ref hg19
有了参考索引，就能进行单端或者双端的比对
可能你会想，现在都是二代PE测序了，为什么还有单端的存在呢？但如果接触了Chipseq数据，就能看到大量的单端测序
# 单端，其中 -p指定线程数
index=/home/genome/hg19
fq=/YOUR_PATH/
bowtie2 -p 5 -x $index -U $fq
# 双端
index=/home/genome/hg19
fq1=/YOUR_PATH/
fq2=/YOUR_PATH/
bowtie2 -p 5 -x $index -1 $fq1 -2 $fq2
必须注意的是，bowtie2 -x这里一定要写好路径，并且是写到前缀，于是可以看到index这个变量就指定到了hg19这里
既然是第二代，那么它的第一代有啥区别？
之前其实一直没有考虑过这个问题，因为大家都用bowtie2，而且各种文章也是用新的版本。就是“喜新厌旧”吗？其实这些在官网都有说过，只不过没有特殊情况，我们一般也不会去看，因为很多的中文教程足够使用。
第一代版本发布于2009年，当时二代测序还没有兴盛，因此它的目标是比对20-50bp的短reads。但是后来随着测序通量（每天测序得到的碱基数更多）和读长的增大（每条read能测到的长度更长），bowtie1不能满足日益发展的比对需求，才有了二代。
主要的区别有：
- 对于长度大于50bp的reads，bowtie2的速度更快，更灵敏，使用的内存也少；但如果小于50bp，依然是bowtie1更快
- bowtie1只寻找没有gap的比对，而bowtie2支持了跨gap的比对，gap的数量和长度都没有限制
- bowtie2支持局部比对（local alignment）和双端比对（end-to-end alignment），双端比对这一点和bowtie1一样
- bowtie2对read长度没有限制，而bowtie1最长1000bp
- bowtie2允许比对参考基因组的未知碱基（N），而bowtie1不可以
- 对于双端测序的reads比对，bowtie2更灵活，因此一会在结果解释中会看到，双端测序的合理比对和不合理比对
重点是结果如何解读
以往都是关注最后一行，也就是最后计算出来的比对率，看着差不多也就得了
看看样子
双端结果如下：
单端结果如下：
需要注意的是，这些具体的比对信息，bowtie2将他存储在了标准错误输出中，也就是说我们需要指定2>align.log这样来保存结果
逐步解读
就以上面👆双端结果为例 其中以
----为分割线，分成了三大部分
第一行：说明一共有12965647对reads进行了比对【注意这里因为是PE测序，所以是一对一对的，如果论条的话，就应该乘以2】
接着，重点关注一个名词：aligned concordantly，直译就是比对结果是不是合理。如果read1和read2都同时比对上，并且比对后的结果也符合逻辑，那么就是合理的；如果read1和read2能同时比对上，但它们各自比对的位置和本身read1、2之间的间隔差距太大，或者它们比对的方向压根就是一样的，这样就是不合理（因为本身测序得到的read1和read2应该比对到不同的链）
分割的第一部分：在共有12965647对reads中
- 3805028 (29.35%)对reads没有合理的比对
- 1212421 (9.35%)对reads合理比对了一次
- 7948198 (61.30%)对reads合理比对了多次
分割的第二部分：在没有合理比对的3805028对reads中
- 535030 (14.06%)对reads 是双端比对但不合理
因此这里要注意了：不合理比对不代表这对reads不重要，它包含了三种情况：都比对上但比对不合理（就是这里的535030）、两个read都没比对上、只有一个read比对上
分割的第三部分：在不合理比对的3805028对reads中，除去双端比对但不合理的535030对，还剩余6539996条（这里没有写3269998对，是因为这些read可能就不是配对的了），可以看图中第三部分使用的词语是mates而不是paired，mates在这里指的就是由不同read组成的群体
- 4021442 (61.49%) 条一次没比对上
- 1314280 (20.10%) 条比对上一次
- 1204274 (18.41%) 条比对上多次
最后计算：84.49% overall alignment rate
如何计算? 其实也就是统计了比对上的条数：
双端比对的结果（比对1次及多次，注意要乘以2）+ 单端比对的结果（比对1次及多次）
# 来自分割的第一部分
1212421 x 2 + 7948198 x 2
# 来自分割的第二部分
535030 x 2
# 来自分割的第三部分
1314280 + 1204274
# 最后总共比对的条数是
21909852
# 全部条数是
12965647 x 2 = 25931294
# 最后的比例就是
21909852/25931294*100%=84.49%
补充
- bowtie2默认会同时寻找
concordant和discordant的比对，除非设置--no-discordant - 和bowtie2类似，举一反三，hisat2的结果也是这么理解
