006-果蝇探索PcG招募机制

Last updated on Jul 5, 2020 10 min read reading

刘小泽写19.10.6

文章来源

Global changes of H3K27me3 domains and Polycomb group protein distribution in the absence of recruiters Spps or Pho

2018年发表于PNAS

https://www.pnas.org/content/115/8/E1839

附图在：https://www.pnas.org/highwire/filestream/794232/field_highwire_adjunct_files/0/pnas.1716299115.sapp.pdf

文章目的

说明三种不同的PcG招募因子（Spps、Pho、Cg）的作用和探索PcG招募机制

需要了解

  • Polycomb group (PcG) 多梳家族蛋白

    细胞所携带信息中仅有约1%的区域产生蛋白,其余的99%通过DNA的甲基化等作用被抑制（http://gb.oversea.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?filename=2010095907.nh&dbcode=CDFD&dbname=CDFD2010），而PcG蛋白就是一群对任何有机体的生长发育都很重要的转录抑制因子，通过表观遗传调控控制基因表达（http://www.biodiscover.com/news/research/116021.html）。

    研究发现，这个蛋白的作用不仅可以控制个体正确的发育模式，还与细胞增殖、分化、x染色体的失活、干细胞的全能性和癌症发生有关。

    PcG 蛋白在进化上是高度保守的, 在线虫、小鼠、人和拟南芥中均已鉴定出其同源蛋白。在人中, PRC2 由EED、EZH2、Su(z)12、RbAp48 和AEBP2 组成。（https://pdfs.semanticscholar.org/f058/4ff3570483eaff8e0efa162076a0ac37184c.pdf）

    PcG复合体介导的H3K27me3 表观修饰在动植物组织特异性发育过程中都具有重要的调控作用（http://www.cas.cn/zkyzs/2018/05/150/kyjz/201805/t20180515_4645702.shtml）

    早期研究分类：

    • 核心蛋白复合体PRC2：在转录抑制起始阶段发挥作用。在果蝇中，PRC2包括Caf1-55、Su(z)12、Esc/Escl、E(z)蛋白【E(z)蛋白执行组蛋白H3K27甲基转移酶功能】
    • PRC1（Polycomb repressive complex 1）：维持处于阻抑状态染色质的稳定性。包括Psc/Su(z)2、Ph、Sce/dRing、Pc蛋白【Pc结合到H3K27me3上】

  • Polycomb response elements（PREs）Polycomb响应元件

    PcG复合物本身并不与DNA特异性结合，而是通过Polycomb响应元件（PREs）的募集等方式到达靶基因的染色质（http://www.klpbcas.com/index.php/News/show/id/201.html）

    PREs包括了Pho/Phol, Spps, Cg, GAF/Psq, Adf-1, Grh, Dsp1, and Zeste/Fsh-S

    • Spps mutants develop into adults that die just before or after they emerge from the pupal case
    • pho maternal mutants die as embryos
    • maternal cg mutants do not lay eggs

  • H3K27me3 组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化修饰

    组蛋白修饰（又称为“标记”）是一类调控基因表达的翻译后修饰。

    修饰的目的是：将基因组调节成易于 DNA 转录的常染色体活性区域或者 不易于转录（DNA 更紧密）的失活异染色质区域，借此调控基因表达

    组蛋白分子结构：组蛋白将 DNA 组装并排列成称为核小体的结构，使其适于存储在细胞核中。每个核小体含有两个亚基，两个亚基均由组蛋白 H2A、H2B、H3 和 H4（称之为核心组蛋白）构成。其中组蛋白 H3 是修饰最多的组蛋白，H3的修饰能预测染色质的类型、区分基因组功能元件（启动子、增强子、基因主体）以及决定这些元件处于活性状态或是抑制状态

    （https://www.abcam.cn/epigenetics/histone-modifications-a-guide-2）

    PcG介导H3K27me3在基因沉默和发育调控中起着至关重要的作用，小鼠胚胎干细胞中超过10%的基因受该种修饰调控，拟南芥中超过7,000个基因受该修饰调控。

    （http://www.cib.ac.cn/xwdt/kjqy/201106/t20110613_3286289.html）

方法

ChIP-seq分析

  • Trim Galore过滤后利用 Bowtie v1.1.2比对到参考基因组（dm3, BDGP Release5）【设置参数：-n 2 -l 28 -k 1 —best】
  • 每个数据集的PCR duplicates用samtools rmdup 去除
  • 检查生物重复：每个生物学重复的基因组上每1kb 作为一个bin，计算其中的normalized signal intensity values 。再计算Pearson相关系数，相关性好的生物学重复的reads组合到一起再进行下面的分析
  • H3K27me3的结构域长度范围从几十到上百kb，peak calling先用SICER v1.1【参数window size = 500, fragment size = 200, effective genome fraction = 0.7, gap size = 2000】 ，根据FDR < 0.1, length > 5kb，two-fold enrichment过滤
  • 其他的PcG factors，peak calling使用MACS v2.1.1【参数-g dm -q 0.05】

RNA-seq分析

  • Trim Galore过滤后用Tophat v2.1.1 比对到（dm3, BDGP Release 5）【参数--no-novel-juncs】

  • cufflinks计算FPKM，cuffnorm normalized different datasets

  • 定量htseq-count

  • 差异基因FDR<0.05 using DESeq2 （排除gene mthl8）

差异peak分析

  • 利用DiffBind分析Pho, Ph and Psc between wild- type and mutant Drosophila strains 【参数：summits set as 250】
  • BEDTools检测overlapping between peaks

ChIP-RPKM计算

image-20191007002733111

Motif分析

每个ChIP-seq数据集中选top 500 peaks =》 MEME-ChIP 【参数：-meme-minw 8 -meme-maxw 12】，侧翼+/- 200 bp from the summit were used

基因注释、富集分析

UCSC下载reference genome (dm3, BDGP Release 5)和注释

HOMER的annotatePeaks.pl script + 默认参数 to annotate the genomic distribution of identified peaks =》top 2000 peaks by peak score from each dataset were used

GO：使用DAVID

结论

第一张主图

在H3K27me3以内的区域，不同招募因子的结合情况

（A）H3K27me3结构域中的三个PcG招募因子比较，三者peaks高度重合，H3K27me3+ Spps peaks的绝大部分（98.6%）和Pho、Cg是一致的。Pho单独的peaks数是587，Cg单独的peaks是743

（B）为了搞清楚不同的招募因子如何结合PcG蛋白，结果根据不同招募因子的结合状态对peaks进行了分组，并检测了每个组中PcG蛋白的结合情况。同时与3个招募因子结合的peaks组（G1），也与其他的PcG蛋白（如E(z)、Ph、Psc、Pc）有很强的结合；只与一个招募因子结合的peaks，在其他的PcG蛋白中结合也较弱【G6组是个例外】

（C）进一步观察AbdB 位点，招募因子不同，PcG结合peaks强弱也不同。一般Spps结合的，Pho和Cg也会结合；绿色的框是只有Pho招募因子存在；黄色框是同时存在Pho和Cg；看到一些峰只在某种招募因子存在下才出现，推测三种招募因子作用不同。

image-20191006173300088

第二张主图

在H3K27me3以外的区域，Spps和Pho结合不同的位点

为何排除了Cg？

在H3K27me3结构域以外，Cg结合的位点更多，相比于Spps和Pho的结合强度更大。有92.3%的Spps和86.2%的Pho在H3K27me3以外和Cg有共同的结合峰（如下图，附图S3-A）。因此在这部分区域主要关注Spps和Pho即可

image-20191006223316440

（A）之前在H3K27me3内部的时候，Spps的峰基本上与Pho是重叠的（见第一张主图A），但是在H3K27me3外部，却有32.1%的Spps和Pho的峰不重叠，说明在H3K27me3外部，这两个结合的区域不一致

image-20191006222257792

（B、C）检测了在H3K27me3外部，每个PcG蛋白与（Spps+Pho、仅Spps、仅Pho）三种招募因子组合的峰的情况。和之前在H3K27me3内部一样，这Spps+Pho方式结合PcG的能力更强。但奇怪的是，在PRC1中，仅Spps的方式结合Ph更强，而仅Pho的方式结合Psc更强，这一点在图C也能体现

（D、E）之后进一步在IGV中进行验证，分别观察了仅有Spps和仅有Pho的富集区域，和B、C中的结论一致

（补充）另外，从B中可以看到，E(z)与这三种招募因子组合都有结合；不过与图1（B）相比，结合能力明显偏弱；Pc与三种结合都非常弱

（附图S4-A）三种招募因子组合得到的peaks在基因组上的分布没有太大差别

image-20191006230355432

（附图S4-B）不过，结合RNA-seq数据，H3K27me3之外的基因，仅Spps招募的比Spps+Pho、仅Pho招募的表达量要低

image-20191006231101607

【整体结论】

在H3K27me3以外，Spps和Pho会因Ph和Psc结合不同的区域，推测它们行使的功能不同；另外PRC1在这些区域结合的蛋白不同

第三张主图

开始敲除PcG招募因子反向验证，敲除后对PcG的结合影响很大

选取的实验材料：三龄幼虫

  • examine PcG binding in third instar larvae that never had Spps protein at any stage of their development 【Spps mutants lacking both maternal and zygotic Spps form phenotypically normal adults that die either during or shortly after eclosion】
  • examined PcG binding and H3K27me3 in third instar larvae from pho or cg zygotic mutants that contained maternally supplied Pho or Cg 【maternal pho and cg are essential for embryogenesis and oo- genesis, respectively】

image-20191006232229504

（图A）在三龄Pho、Spps突变体中检查H3K27me3, Pho, Ph, and Psc都是正常的；Pho、Cg在各自的突变体中敲除后都基本检测不到

（图B）每个H3K27me3结构域计算了ChIP-reads per kilobase million (ChIP-RPKM) ，结果各个突变体都有降低，而且Spps、Pho的影响更大

（结合A+B图）重要的是，缺少Pho、Spps对总的H3K27me3含量基本无影响，而且E(z)也基本没变化。因此，更加推测H3K27me3的减少与Polycomb 结构域有关。

（附图S6）比较了不同突变体的H3K27me3变化相关性，发现干扰Spps和Pho后对H3K27me3改变更一致

image-20191006233857595

（附图S7+图C）检查了没有Spps时PcG蛋白的结合，结果显示：Spps突变体的Pho, E(z), Ph, 、和Psc结合显著下降；另外在H3K27me3内外变化程度不同。有趣的是，Ph表现的和其他几个不同，Pho, E(z)和Psc在H3K27me3内部受Spps影响更大；而Ph在H3K27me3外部受Spps影响更大

image-20191006234201625

（附图S8）另外检查了在pho、cg突变体中的Ph变化，也都是在H3K27me3外部结合的下降更多

image-20191006234617053

（附图S9）用两个独立的样本结合ChIP-qPCR来验证

image-20191006234734478

第四张主图

（左边）在exex位点，取野生型和spps突变型展示H3K27me3和PcG的结合情况；（右边）HGTX位点

image-20191006235147507

（图A）首先看到spps突变体的H3K27me3下降的更快；其次是pho突变体，最后是cg突变体

在PcG中有一个强的和两个弱一点的结合区域。没有spps时（WT vs Spps），Pho, Psc, Ph, 和E(z)在所有位点的结合显著减少，因此，H3K27me3以及Pho, E(z), Psc, Ph在这个位点的招募依赖于Spps

（图B）对于HGTX位点，spps突变体的H3K27me3也是下降，但不如exex位点下降的多；没有spps的情况下，第三个峰处没有E(z)和Psc，甚至Pho、Ph的峰也是一点点。

因此，PRC1, PRC2, 和 Pho的招募完全取决于Spps

第五张主图

abd-B位点，同时比较WT和其他三种突变体

image-20191007000731974

也是探索了各个PcG在不同突变体中的变化

其中黑色框是spps突变体的变化，红色框是cg突变体中Ph的变化。

欢迎关注我们的公众号～_～　　 我们是两个农转生信的小硕，打造生信星球，想让它成为一个不拽术语、通俗易懂的生信知识平台。需要帮助或提出意见请后台留言或发送邮件到 jieandze1314@gmail.com Welcome to our bioinfoplanet!

paper epigenomics
Yunze Liu
Yunze Liu
Bioinformatics Sharer

Co-founder of Bioinfoplanet(生信星球)

Next
Previous

Related